Опыт разработки и валидации метода определения тестостерона в сыворотке крови женщин репродуктивного возраста с использованием высокоэффективной жидкостной обращённо-фазовой хроматографии с тандемной масс-селективной детекцией аналита

Обоснование. Исследование тестостерона является основным методом выявления гиперандрогенизма, одного из важных критериев диагностики синдрома поликистозных яичников (СПКЯ). Жидкостная тандемная массспектрометрия (ЖХ-МС/МС) рассматривается в настоящее время как наиболее предпочтительный метод определения тестостерона у женщин, а его валидация является необходимым этапом для обеспечения воспроизводимых результатов исследования андрогенов в клинической практике и при проведении популяционных исследований распространённости СПКЯ.
Цель работы. Разработать и валидировать метод определения общего тестостерона в сыворотке крови с использованием высокоэффективной ЖХ-МС/МС для диагностики гиперандрогенемии при проведении эпидемиологического исследования распространённости синдрома поликистозных яичников и его фенотипов в Восточной Сибири (ESPEP STUDY).
Материалы и методы. Определение тестостерона в сыворотке крови проводилось с применением трёхквадрупольного тандемного массспектрометра LCMS-8060 (Shimadzu, Япония). Метод разработан с применением самостоятельно приготовленных образцов очищенной сыворотки крови человека, свободной от тестостерона, с известным содержанием исследуемого аналита. При апробации методики использованы образцы сыворотки крови женщин репродуктивного возраста.
Результаты. В ходе разработки метода оптимальные хроматографические условия получили при использовании колонки Kromasil 100-2.5-C18 (2,1 мм × 100 мм; AkzoNobel, Нидерланды), при изократическом режиме элюирования с применением подвижной фазы, состоящей из ацетонитрила и 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты. Общая скорость потока составила 0,35 мл/мин. Нижний предел количественного определения составил 5 нг/дл со средней точностью 100,2 %. При апробации метода в тестовой популяционной выборке из 1138 женщин репродуктивного возраста (средний возраст – 34,3 ± 6,3 года) медиана концентрации тестостерона составила 26,9 нг/дл.
Заключение. Предложенный метод определения тестостерона в сыворотке крови обладает приемлемой точностью, линейностью и воспроизводимостью, характеризуется простой и быстрой пробоподготовкой и может использоваться при проведении популяционных эпидемиологических исследований распространённости СПКЯ и его фенотипов и в клинической практике.

1. Lizneva D, Suturina L, Walker W, Brakta S, Gavrilova-Jordan L, Azziz R. Criteria, prevalence, and phenotypes of polycystic ovary syndrome. Fertil Steril. 2016; 106(1): 6-15. doi: 10.1016/j.fertnstert.2016.05.003

2. Teede HJ, Misso ML, Costello MF, Dokras A, Laven J, Moran L, et al. Recommendations from the international evidence-based guideline for the assessment and management of polycystic ovary syndrome. Fertil Steril. 2018; 110(3): 364-379. doi: 10.1016/j.fertnstert.2018.05.004

3. Fauser BC, Tarlatzis BC, Rebar RW, Legro RS, Balen AH, Lobo R, et al. Consensus on women’s health aspects of polycystic ovary syndrome (PCOS): The Amsterdam ESHRE/ASRM-Sponsored 3rd PCOS Consensus Workshop Group. Fertil Steril. 2012; 97(1): 28-38.e25. doi: 10.1016/j.fertnstert.2011.09.024

4. Lizneva D, Gavrilova-Jordan L, Walker W, Azziz R. Androgen excess: Investigations and management. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2016; 37: 98-118. doi: 10.1016/j.bpobgyn.2016.05.003

5. Bozdag G, Mumusoglu S, Zengin D, Karabulut E, Yildiz BO. The prevalence and phenotypic features of polycystic ovary syndrome: A systematic review and meta-analysis. Hum Reprod. 2016; 31(12): 2841-2855. doi: 10.1093/humrep/dew218

6. Boyle JA, Cunningham J, O’Dea K, Dunbar T, Norman RJ. Prevalence of polycystic ovary syndrome in a sample of Indigenous women in Darwin, Australia. Med J Aust. 2012; 196(1): 62-66. doi: 10.5694/mja11.10553

7. Azziz R, Kintziger K, Li R, Laven J, Morin-Papunen L, Merkin SS, et al. Recommendations for epidemiologic and phenotypic research in polycystic ovary syndrome: An androgen excess and PCOS society resource. Hum Reprod. 2019; 34(11): 2254-2265. doi: 10.1093/humrep/dez185

8. Chen Y, Yazdanpanah M, Hoffman BR, Diamandis EP, Wong PY. Rapid determination of serum testosterone by liquid chromatography-isotope dilution tandem mass spectrometry and a split sample comparison with three automated immunoassays. Clin Biochem. 2009; 42(6): 484-490. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2008.11.009

9. Rosner W, Auchus RJ, Azziz R, Sluss PM, Raff H. Position statement: Utility, limitations, and pitfalls in measuring testosterone: An Endocrine Society position statement. J Clin Endocrinol Metab. 2007; 92(2): 405-413. doi: 10.1210/jc.2006-1864

10. Salameh WA, Redor-Goldman MM, Clarke NJ, Mathur R, Azziz R, Reitz RE. Specificity and predictive value of circulating testosterone assessed by tandem mass spectrometry for the diagnosis of polycystic ovary syndrome by the National Institutes of Health 1990 criteria. Fertil Steril. 2014; 101(4): 1135-1141.e2. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.12.056

11. Stanczyk FZ, Clarke NJ. Advantages and challenges of mass spectrometry assays for steroid hormones. J Steroid Biochem Mol Bio. 2010; 121(3-5): 491-495. doi: 10.1016/j.jsbmb.2010.05.001

12. Fanelli F, Gambineri A, Mezzullo M, Vicennati V, Pelusi C, Pasquali R, et al. Revisiting hyper- and hypo-androgenism by tandem mass spectrometry. Rev Endocr Metab Disord. 2013; 14(2): 185-205. doi: 10.1007/s11154-013-9243-y

13. Wierman ME, Auchus RJ, Haisenleder DJ, Hall JE, Handelsman D, Hankinson S, et al. Editorial: The new instructions to authors for the reporting of steroid hormone measurements. Mol Endocrinol. 2014; 28(12): 1917. doi: 10.1210/me.2014-1285

14. Tosi F, Fiers T, Kaufman JM, Dall’Alda M, Moretta R, Giagulli VA, et al. Implications of androgen assay accuracy in the phenotyping of women with polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol Metab. 2016; 101(2): 610-618. doi: 10.1210/jc.2015-2807

15. Trabert B, Xu X, Falk RT, Guillemette C, Stanczyk FZ, McGlynn KA. Assay reproducibility of serum androgen measurements using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Steroid Biochem Mol Biol. 2016; 155(PtA): 56-62. doi: 10.1016/j.jsbmb.2015.09.032

16. Suturina L, Lizneva D, Danusevich I, Lazareva L, Belenkaya L, Nadeliaeva I, et al. The design, methodology, and recruitment rate for the Eastern Siberia PCOS epidemiology&phenotype (ES-PEP) Study. Abstracts of the 41st Annual Meeting of the Androgen Excess & PCOS Society. Lorne, Victoria, Australia; 2016: 76.

17. Deshpande M, Kasture S, Mohan M, Chavan M. Bioanalytical method development and validation: A review. In: Muharrem L, Olcay Kaplan I (еds) Recent Advances in Analytical Chemistry. London: Intech Open; 2019.

18. Boterman M, Doig M, Breda M, Lowes S, Jersey J, Shoup R, et al. Recommendations on the interpretation of the new European Medicines Agency Guideline on Bioanalytical Method Validation by Global CRO Council for Bioanalysis (GCC). Bioanalysis. 2012; 4(6): 651-660. doi: 10.4155/bio.12.18

19. Fiandalo MV, Wilton JH, Mantione KM, Wrzosek C, Attwood KM, Wu Y, et al. Serum-free complete medium, an alternative medium to mimic androgen deprivation in human prostate cancer cell line models. Prostate. 2018; 78(3): 213-221. doi: 10.1002/pros.23459

20. Zhang J, Wu H, Kim E, El-Shourbagy TA. Salting-out assisted liquid/liquid extraction with acetonitrile: A new high through put sample preparation technique for good laboratory practice bioanalysis using liquid chromatography-mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 2019; 23(4): 419-425. doi: 10.1002/bmc.1135

21. Salameh WA, Redor-Goldman MM, Clarke NJ, Reitz RE, Caulfield MP. Validation of a total testosterone assay using highturbulence liquid chromatography tandem mass spectrometry: total and free testosterone reference ranges. Steroids. 2010; 75(2): 169-175. doi: 10.1016/j.steroids.2009.11.004

22. Alvi SN, Hammami MM. An improved method for measurement of testosterone in human plasma and saliva by ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Adv Pharm Technol Res. 2020; 11(2): 64-68. doi: 10.4103/japtr.JAPTR_162_19

23. van Nuland M, Venekamp N, Wouters WME, van Rossum HH, Rosing H, Beijnen JH. LC-MS/MS assay for the quantification of testosterone, dihydrotestosterone, androstenedione, cortisol and prednisone in plasma from castrated prostate cancer patients treated with abiraterone acetate or enzalutamide. J Pharm Biomed Anal. 2019; 170: 161-168. doi: 10.1016/j.jpba.2019.03.043